Diagnóstico da tuberculose bovina por ELISA com proteínas recombinantes

Abstract

A tuberculose bovina é uma importante enfermidade infecciosa, causada pela bactéria Mycobacterium bovis. O gene que codifica para a proteína MPB70 está presente no genoma de M. bovis e apresenta alta especificidade para o complexo M. tuberculosis, representando um potencial antígeno para o diagnóstico da tuberculose bovina. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ELISA utilizando-se a proteína recombinante MPB70 de M. bovis para detecção de anticorpos contra essa bactéria em bovinos. O gene mpb70 foi amplificado por PCR e clonado em plasmídeo pGEM-T Easy. Após digestão com a enzima Eco RI, o gene foi subclonado em plasmídeo de expressão pGEX-3X. A expressão do gene foi verificada por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e coloração com azul brilhante de Coomassie; bem como por meio de Western blot com anticorpo anti-glutationa-S-transferase (GST). Após padronização do ELISA, foram testadas 137 amostras de soros bovinos positivos, negativos e inconclusivos na tuberculinização. Na eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida foi possível observar uma proteína recombinante aproximadamente 48 kDa, que corresponde à massa molecular estimada da fusão GST/MPB70. No Western blot, a MPB70 recombinante fusionada à GST, foi reconhecida pelo anticorpo anti-GST, confirmando a expressão do gene. Para o ELISA com MPB70 recombinante, detectou-se sensibilidade e especificidade de 88,7% e 94,6%, respectivamente. A utilização de um teste sorológico, como o ELISA com MPB70 recombinante, em conjunto com os testes celulares, poderá elucidar uma parte dos problemas encontrados nos programas de controle da tuberculose bovina, como o alto número de resultados inconclusivos e a não detecção de animais anérgicos em fase avançada da doença. Além disso, pode também ser utilizado como teste de triagem de tuberculose bovina, previamente à confirmação com intradermorreação.

Bovine tuberculosis is an important infectious disease, caused by Mycobacterium bovis. The gene that encodes for MPB70 protein is present in the genome of M. bovis and has high specificity for the M. tuberculosis complex, representing a potential antigen for the diagnosis of bovine tuberculosis. The objective of this work was to develop an ELISA using recombinant protein MPB70 of M. bovis in order to detect antibodies against these bacteria in cattle. The gene mpb70 was amplified by PCR and cloned into plasmid pGEM-T Easy. After digestion with the Eco RI enzyme, the gene was subcloned into the expression plasmid pGEX-3X. The expression of the gene was verified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-page) and Coomassie blue staining. Western blot with anti-glutathione- S-transferase (GST) was also performed. After standardization of the ELISA, 137 serum samples of positive, negative and inconclusive cattle in the tuberculin test were tested. In SDS-page, a recombinant protein of approximately 48 kDa was detected, which corresponds to the estimated molecular weight of GST/MPB70. In Western blot, recombinant MPB70, fused to GST, was recognized by anti-GST antibody, confirming the expression of the gene. For the ELISA with recombinant MPB70, the sensitivity and specificity found were 88.7% and 94.6% respectively. The use of a serological test such as ELISA with recombinant MPB70, together with the cellular tests, may solve some of the problems found in the control programs of bovine tuberculosis, like the high number of inconclusive results and the lack of detection of anergic animals in advanced stages of the disease. In addition, it can be used as a screening assay for bovine tuberculosis, prior to the tuberculin test.