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https://repositorio.ufms.br/handle/123456789/5834| Tipo: | Tese |
| Título: | DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDES COM RESISTÊNCIA BACTERIANA |
| Autor(es): | Isabela Furtado |
| Primeiro orientador: | Durval Batista Palhares |
| Resumo: | Introdução: A sepse neonatal permanece como sendo uma causa significante de morbidade e mortalidade, apesar de consideráveis progressos de higiene, introdução de novos agentes antimicrobianos e avançadas medidas para diagnóstico precoce. Estafilococos, mas principalmente os S. epidermidis, além de colonizarem, também infectam pacientes fisiologicamente imunocomprometidos. A mortalidade relativa à sepse neonatal é prevenida com terapia antimicrobiana racional, nutricional e cuidados de suporte agressivos. Objetivos: Esta pesquisa teve por objetivo geral realizar o diagnóstico molecular de resistência bacteriana em cepas de S. epidermidis. Além de observar a expressão molecular de mRNA pelo fragmento do gene mecA através das cepas de S. epidermidis resistentes à meticilina, após serem testadas ou não ao ensaio in vitro com extratos antimicrobianos. Metodologia: No presente estudo o RNA total foi obtido de modo inovador diretamente das colônias das bactérias resistentes e colocados em RNA later para extração. Foram utilizadas duas cepas de S. epidermidis, resistentes à meticilina para detecção do gene mecA e para tanto foram utilizados primers iniciadores de fragmentos específicos desse gene, os quais foram usados para a RT-qPCR para amplificação e detecção do gene alvo. Foi utilizado um método para coleta e diagnóstico de resistência em S. epidermidis, resistente à meticilina, utilizando-se de forma inédita RNAlater como reagente onde as cepas foram diretamente tiradas da placa de microdiluição e acondicionadas para posterior diagnóstico. Utilizou-se o primer universal para infecções bacterianas como normalizador da reação qPCR. As curvas de amplificação e calibração para as bactérias resistentes puderam ser obtidas e analisadas por RT-qPCR dos cDNAs bacterianos. Resultados: Foram avaliadas amostras bacterianas de S. epidermidis resistente à meticilina e a quantidade de RNA total extraído obtido foi viável em todas as cepas analisadas, sendo 24 amostras em quadruplicata, com valores de até 918 ng/µl em volume total de 50 µl. O RT-qPCR para todas as amostras demonstrou positividade para o gene analisado mecA, com exceção da única cepa da bactéria não resistente como controle negativo. A eficiência da reação foi obtida, conforme slope da curva de calibração. Conclusão: As amostras de RNA extraídas e quantificadas se mostraram extremamente viáveis para detecção por meio de RT-qPCR, tratando-se de um método extremamente sensível e capaz de detectar quantidades variáveis de mRNA nas amostras analisadas. O método para coleta e diagnóstico de resistência em S. epidermidis, resistente à meticilina, utilizou, de forma inédita, RNAlater como reagente de conservação das moléculas de RNA em que as cepas foram diretamente tiradas da placa de microdiluição e acondicionadas para posterior extração e diagnóstico. Constituindo-se em um procedimento de fácil execução e boa praticidade. Além de que tal metodologia por qPCR forneceu um resultado quantitativo e sensível para tais cepas. Assim, os resultados deste estudo mostram este método como ferramenta eficaz para detecção do gene de resistência molecular mecA em S. epidermidis resistente à meticilina e se mostra importante para detecção de infecções cujo microrganismo se encontra vivo. O método também se mostra capaz de detectar variações de expressão gênica conforme pôde ser observado e que pode explicar diferentes índices de virulência entre cepas desta bactéria. |
| Abstract: | Introduction: Neonatal sepsis remains a significant cause of morbidity and mortality despite considerable advances in hygiene, introduction of new antimicrobial agents, and advanced measures for early diagnosis. Staphylococci, but mainly S. epidermidis, in addition to colonizing, also infect physiologically immunocompromised patients. Mortality related to neonatal sepsis is prevented with rational antimicrobial therapy, nutrition, and aggressive supportive care. Objectives: The general objective of this research was to carry out the molecular diagnosis of bacterial resistance in strains of S. epidermidis with bacterial resistance. In addition to observing the molecular expression of mRNA by the mecA gene fragment through strains of S. epidermidis resistant to methicillin, after being tested or not in the in vitro assay with antimicrobial extract. Methodology: In the present study, total RNA was obtained in an innovative way directly from colonies of resistant bacteria and later placed in RNA for inheritance. Two strains of S. epidermidis, resistant to methicillin, were used for detection of the mecA gene and, for that purpose, primers initiating specific fragments of this gene were used, which were used for RT-qPCR for amplification and detection of the target gene. Universal primer for bacterial bacteria was used as a qPCR reaction normalizer. Amplification curves for remaining resistant bacteria were carried over by RT-qPCR to obtain the bacterial cDNAs obtained. Calibration curves and detection of viable bacterial cDNA were also observed. Results: Bacterial samples of methicillin-resistant S. epidermidis were evaluated and the amount of extracted RNA obtained was viable in all analyzed strains, 24 samples in quadruplicate, with values of up to 918 ng/µl in a total volume of 50 µl. RT-qPCR for all samples demonstrated positivity for the analyzed mecA gene, with the exception of the single strain of non-resistant bacteria as a negative control. The reaction efficiency was obtained according to the slope of the calibration curve. Conclusion: The extracted and quantified RNA samples proved to be extremely viable for detection by means of RT-qPCR, being an extremely sensitive method capable of detecting variable amounts of mRNA in the analyzed samples. The method for collection and diagnosis of resistance in S. epidermidis, resistant to methicillin, used, in an unprecedented way, RNAlater as a conservation reagent for RNA molecules in which the strains were directly removed from the microdilution plate and conditioned for later extraction and diagnosis. It constitutes a procedure of easy execution and good practicality. In addition, such a methodology by qPCR provided a quantitative and sensitive result for such strains.Thus, the results of this study show that this method is an effective tool for detecting the mec A molecular resistance gene in methicillin-resistant S. epidermidis and is important for detecting infections in which the microorganism is alive. The method is also capable of detecting variations in gene expression as observed and which may explain different virulence rates among strains of this bacterium. |
| Palavras-chave: | - |
| País: | Brasil |
| Editor: | Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul |
| Sigla da Instituição: | UFMS |
| Tipo de acesso: | Acesso Restrito |
| URI: | https://repositorio.ufms.br/handle/123456789/5834 |
| Data do documento: | 2023 |
| Aparece nas coleções: | Programa de Pós-graduação em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste |
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