Purificação e caracterização bioquímica das amilases produzidas por aspergillus sp. e neurospora crassa exo-1: imobilização da enzima em alginato de sódio

Abstract

O complexo amilolítico possui enzimas de grande importância industrial, como a α-amilase e a glucoamilase, que catalisam a hidrólise do amido. Fungos filamentosos são capazes de produzir enzimas amilolíticas e dentre eles estão os do gênero Aspergillus, que se destacam como excelentes produtores e o Neurospora crassa Mutante exo-1 que é conhecido pela hiperexpressão da glucoamilase. O presente trabalho teve por objetivo purificar, imobilizar e caracterizar amilases produzidas pelos fungos Aspergillus sp. e Neurospora crassa Mutante exo-1. A α-amilase produzida pelo fungo Aspergillus sp. obteve purificação em coluna DEAE-Celulose de 7,59 vezes e 82,79 % de rendimento. A análise eletroforética em SDS-PAGE a 7 % revelou uma banda bem definida de peso molecular aproximado de 87 kDa. A imobilização foi realizada em alginato de sódio 3,5 % e cloreto de cálcio 0,5 M apresentando em torno de 40 % de atividade após o quarto e quinto ciclo de reuso. Os valores de pH e temperatura ótimos, para as enzimas livre e imobilizada, foram 4,5 e 65 °C e 4,5 e 60 °C, respectivamente. Os testes de estabilidade ao pH da enzima imobilizada mantiveram valores próximos a 100 %, enquanto que a livre apresentou queda de 50 % da atividade em todas as faixas de pH nos primeiros 10 minutos de incubação. Na estabilidade a temperatura a enzima imobilizada manteve 100 % de atividade em 40 °C, decaindo para 34 % quando elevada até 45 °C, 42 % a 50 °C e 69 % em 55 °C. A enzima livre apresentou 100 % de atividade em 40 e 55 °C, 70 % em 45 °C e 87 % em 50 °C. A glucoamilase produzida pelo Neurospora crassa Mutante exo-1 apresentou purificação de 1,75 vezes com 31,27 % de rendimento em precipitação com sulfato de amônio e coluna DEAE-Celulose. A análise eletroforética SDS-PAGE a 7 % mostrou uma única banda bem definida. Para a imobilização foram utilizados os valores otimizados de 4 % de alginato e cloreto de cálcio 0,1 M mantendo 35 % da atividade do quarto ao sexto ciclo. Os valores de pH e temperaturas ótimos obtidos para a enzima livre e imobilizada foram de pH 5,0 e 65 °C e pH 5,5 e 55 °C, respectivamente. No teste de estabilidade ao pH a enzima livre demonstrou estabilidade em pH 4,0-8,0, a enzima imobilizada reteve menos de 20 % da atividade em 10 minutos de incubação em todos os pH. Na estabilidade a temperatura a enzima livre também apresentou melhores resultados quando comparado a enzima imobilizada, retendo aproximadamente 100 % de sua atividade a 40 e 45 °C, enquanto que a imobilizada reteve menos de 15 % da atividade em todas as temperaturas após 60 minutos de incubação. Os resultados revelaram que a imobilização se mostrou promissora por ser de fácil processamento, baixo custo e pela possibilidade de recuperação e reutilização da enzima.

ABSTRACT - The amylolytic complex has enzymes of great industrial importance, such as α-amylase and glucoamylase that catalyze the hydrolysis of starch. Filamentous fungi are able to produce amylolytic enzymes, among them are Aspergillus sp., they stand out as excellent producers and Neurospora crassa Mutant exo-1 which is known to overexpress glucoamylase. The present work has the purpouse to purify, immobilize and characterize amylases produced by the fungi Aspergillus sp. and Neurospora crassa mutant exo-1. The α-amylase produced by the fungus Aspergillus sp. obtained purification on a DEAE-Cellulose column of 7.59 fold and 82,79 % yield. Electrophoretic analysis on 7% SDS-PAGE revealed a well-defined band of molecular weight approximate of 87 kDa. The immobilization was carried out in sodium alginate 3.5 % and calcium chloride 0.5 M with 40 % activity after the fourth and fifth reuse cycle. The optimum pH and temperature values, for free and immobilized enzymes, were 4.5 and 65 °C and 4.5 and 60 °C, respectively. The pH stability tests of the immobilized enzyme remained close to 100 % while the free form showed 50 % decrease in activity in all pH ranges in the first 10 minutes of incubation. In the temperature stability the immobilized enzyme maintained 100 % activity at 40 °C, decreasing to 34 % when raised to 45 °C, 42 % at 50 °C and 69 % at 55 °C. The free enzyme showed 100 % activity at 40 and 55 °C, 70 % at 45 °C and 87 % at 50 °C. Glucoamylase produced by Neurospora crassa mutant exo-1 showed a purification of 1.75 fold and 31.27 % yield in ammonium sulfate precipitation and DEAE-Cellulose column. Electrophoretic analysis on 7% SDS-PAGE showed a single well-defined band. For the immobilization, the optimized values of 4 % of alginate and 0.1 M calcium chloride were used, maintaining 35 % of the activity from fourth to sixth cycle. The optimum pH and temperatures values obtained for the free and immobilized enzymes were pH 5.0 and 65 °C and pH 5.5 and 55 °C, respectively. In pH stability test the free enzyme demonstrated great stability at pH 4.0-8.0, the immobilized enzyme retained less than 20 % of activity in 10 minutes of incubation at all pH. In temperature stability the free enzyme also presented better results when compared with immobilized enzyme, retaining approximately 100 % of its activity at 40 and 45 °C, while immobilized retained less them 15 % of activity at all temperatures after 60 minutes of incubation. Results reveled that immobilization showed itself promising because it was easy to process, low cost and possibility of recovery and reuse of the enzyme.