Efeitos do ácido all-trans-retinóico na proliferação, diferenciação, indução de apoptose e expressão gênica em células tronco mesenquimais humanas

Abstract

O ácido all-trans-retinóico (ATRA), é conhecido com uma das formas mais ativas da vitamina A, que participa da regulação da proliferação, diferenciação e apoptose de diversos tipos celulares. Este metabólito possui influência direta sobre a biologia dos adipócitos, atuando no processo de emagrecimento por meio da redução dos processos de adipogênese e lipogênese. O propósito desta pesquisa foi avaliar o efeito do ATRA na diferenciação in vitro das células-tronco mesenquimais (CTM) humanas em adipócitos bem como a indução de apoptose ao longo desse processo. Para essa avaliação, as células foram submetidas a tratamento com ATRA, nas concentrações de 0,5, 5, 50 e 100μM, por 24, 48 e 72 horas. Depois a IC50 (20.75 μM) foi estabelecida e usada para tratamentos de 7 dias sendo as culturas de CTM, CTM induzida a diferenciação por 7 dias e CTM induzida à diferenciação por 14 dias. Para os ensaios de citometria de fluxo e de expressão gênica foi utilizada a IC50 em tratamentos de 12h. Verificou-se que as concentrações de 20.75, 50 e 100μM causam redução significativa da viabilidade celular, tanto em CTM como em células induzidas à diferenciação adipogênica o que sugere efeito citostático/citotóxico. Quando avaliado o ciclo celular observou-se que o ATRA aumentou a frequência de células em Sub-G1em 4,02x e reduziu a frequência de células em G1 em 2,54x. Observou-se ainda que a perda da integridade da membrana aumentou em 4,66x nas culturas tratadas com a ATRA. Já os eventos de apoptose aumentaram 33,56x. O ensaio de expressão gênica sugere que o tratamento com ATRA leva à permeabilização da membrana mitocondrial e consequente liberação de moléculas pró-apoptóticas BAK e BAX (aumento da expressão de 5,5 e 5,4x, respectivamente), e aumento da expressão de CASP3 (8,8x). Estes eventos podem ativar a expressão de Bcl-2 (aumento de 4,1x), GADD45 (aumento 3,14x) e PPAR- γ (aumento de 16x) bem como reduzir a expressão de P53 (-1,38x). Sugere-se ainda que esses eventos são mediados pelo aumento da expressão do RARα (3,8x). Diante do exposto infere-se que o ATRA pode ser uma boa estratégia para o desenvolvimento de terapias para o controle da obesidade visto que ele interfere na diferenciação e morte celular de CTM, pré-adipócitos e adipócitos.

ABSTRACT - All trans-retinoic acid (ATRA) is the most active form of vitamin A that participates in the regulation of proliferation, differentiation and apoptosis of several cell types, but principally in adipocytes, causing weight loss through the reduction of the processes of adipogenesis and lipogenesis. The objective of this study was to evaluate the effect of ATRA during in vitro differentiation of adipose-derived stem cells (ADSCs) in adipocytes as well as the induction of apoptosis throughout this process. For this evaluation, the cells were submitted to treatment with ATRA, at concentrations of 0.5, 5, 50 and 100 μM, for 24, 48 and 72 hours. Then the IC50 (20.75 μM) was established and used for 7 days in treatments with ADSCs, ADSCs induced to differentiation for 7 days and 14 days. For flow cytometry and gene expression assay the IC50 was used in 12h treatments. In flow cytometry and gene expression assays the cells were treated at a concentration of 20.75 μM for 12h. When evaluated the cell cycle it was observed that ATRA increased the frequency of cells in Sub-G1 at 4.02x and decreased the frequency of cells in G1 in 2.54x. It was also observed that loss of membrane integrity increased 4.66x and in apoptosis increased 33,56x, in ATRA treated cultures. The gene expression assay suggests that the treatment with ATRA leads to the permeabilization of the mitochondrial membrane and consequent release of prokoptotic BAK and BAX molecules (increased expression of 5.5 and 5.4x, respectively), and increased expression of CASP3 (8.8x). These events may activate expression of Bcl-2 (4.1x increase), GADD45 (increase 3.14x) and PPAR- γ (16x increase) as well as reduce p53 (-1.38x) expression. It is further suggested that these events are mediated by increased RARα expression (3.8x). Considering the results, it is inferred that ATRA may be a good strategy for the development of therapies to control obesity, since it interferes not only in ADSCs differentiation but also in apoptosis of ADSCs, preadipocytes and adipocytes.