Caracterização fenotípica das células com função imunorregulatória em amostras de cérvice uterina

Abstract

A resposta imune específica ao Papilomavírus humano (HPV) no microambiente cervical desempenha papel importante na erradicação da infecção e na eliminação de células mutadas. Essa resposta depende da expressão de moléculas apresentadoras de antígenos e de citocinas produzidas por diferentes fenótipos celulares no local da infecção. No entanto, genótipos de HPV de alto risco oncogênico modulam as células do sistema imune, de forma a induzir nessas um perfil imunossupressor via produção da citocina IL-10, a fim de não serem eliminados. O desenvolvimento deste microambiente imunossuprimido contribui, juntamente com a infecção, para o surgimento de lesões neoplásicas. O objetivo deste estudo foi caracterizar os fenótipos celulares com função imunorregulatória em amostras de cérvice uterina. Desta forma, foram analisadas 84 biópsias de cérvice uterina de pacientes entre 18 e 69 anos (média 39,2 anos), incluindo amostras negativas para lesão intraepitelial e malignidade - NILM (n = 5), com neoplasia intraepitelial cervical de grau I – NICI (n = 21), grau II - NICII (n = 20), grau III - NICIII (n = 16) e carcinoma cervical - CA (n=22), emblocadas em parafina e previamente submetidas à avaliação histopatológica e detecção de HPV-DNA com determinação da carga viral por PCR em tempo real. Pesquisou-se a produção de IL-10 por macrófagos (CD68+ e CD11b+), células de Langerhans (S100+) e células T Regulatórias (Foxp3+) por imuno-histoquímica de dupla marcação. Por marcação simples, pesquisou-se Células Apresentadoras de Antígeno (APC) e queratinócitos expressando MHC II e queratinócitos produzindo IL-10. As lâminas confeccionadas foram digitalizadas e analisadas no software ImageJ para confirmação da dupla marcação, determinação da área das imagens e quantificação das células imunomarcadas. A densidade destas células foi relacionada com o grau das lesões, idade das participantes, carga viral (CV) do HPV e presença de infecção simples ou múltipla. Este estudo foi aprovado pelo CEP UFMS (nº 1628/10). O aumento da produção de IL-10 por todos os fenótipos celulares estudados e da expressão de MHC II por APC e queratinócitos foi associado à lesões neoplásicas cervicais de alto grau. Observou-se também, maior densidade dos fenótipos celulares com perfil imunossupressor em pacientes maiores de 30 anos, alta carga viral e, preferencialmente, entre as infectadas por um único tipo viral, sobretudo por tipos de alto risco oncogênico. Estes resultados indicam que existe um microambiente imunossuprimido composto por elevada quantidade de macrófagos, células de Langerhans, células T regulatórias e queratinócitos produtores de IL-10 em uníssono com o aumento da densidade de APC e queratinócitos MHC II+ nas amostras classificadas como lesões de alto grau (NICII/NICIII) e CA. A imunossupressão corroborada por estes diferentes fenótipos, somada ao aumento da expressão de MHC II nas lesões induzidas por HPV, proporcionam um microambiente favorável à persistência viral e à progressão neoplásica.

ABSTRACT - A specific immune response to human papillomavirus (HPV) in the cervical microenvironment plays an important role in eradicating infection, and eliminating mutated cells. This response is dependent on the expression of antigen-presenting molecules and cytokines produced by different cellular phenotypes at the infection site. However, However, high-risk HPVs modulate immune cells to create an immunosuppressive microenvironment, and induce these immune cells to produce interleukin 10 (IL-10). The development of this immunosuppressed microenvironment contributes, together with the infection, to the onset of neoplasic lesions. The objective of this study was to characterize the cellular phenotypes with immunoregulatory function in uterine cervix samples. In this way were analyzed 84 biopsies of uterine cervix of patients between 18 and 69 years (mean 39.2 years), including negative samples for intraepithelial lesion and malignancy (n = 5), cervical intraepithelial neoplasia grade I (n = 21), grade II (n = 20), grade III (n = 16) and cervical carcinoma (n = 22), paraffin-embedded and previously submitted to histopathological evaluation and detection of HPV DNA with viral load determination by Real-time PCR. We analyzed the production of IL-10 by macrophages (CD68+ and CD11b+), Langerhans cells (S100+) and Regulatory T cells (Foxp3+) by double staining immunohistochemistry. By simple staining immunohistochemistry, it was researched antigen-presenting cells and keratinocytes expressing MHC II and keratinocytes producing IL-10. The prepared slides were scanned and analyzed with ImageJ software for confirmation of double staining, determination of area of images and density of immunostained cells. The density of these cells was related with lesion grade, age of participants, viral load of HPV and presence of single or multiple infections. This study was approved by the UFMS ethics committee (No. 1628/10). The increase in IL-10 production in all studied cellular phenotypes and MHC II expression by keratinocytes and APC was associated with the progression of cervical neoplasia. It was also observed higher density of immunosuppressive phenotypes in patients aged over 30 years, with high viral load, and predominantly, among those infected with a single viral type, particularly for high-risk oncogenic types. These results indicate an immunosuppressed microenvironment with high amount of macrophages, Langerhans cells, regulatory T cells and keratinocytes producing IL-10 together with an increased density of MHC II+ APC and keratinocytes in the samples classified as high grade cervical lesion (NICII / NICIII) and cervical cancer. Immunosuppression developed by these different phenotypes, in addition to increased MHC II expression in HPV-induced lesions, provide a favorable microenvironment for viral persistence and neoplastic progression.