Isolamento, caracterização morfológica e molecular de bactérias endofíticas e epifíticas em espécies de Bromeliaceae de bancadas lateríticas, Corumbá, Mato Grosso do Sul

Abstract

A associação de bactérias com plantas é amplamente estudada em diferentes ambientes, principalmente com plantas cultivadas. Porém, é necessário expandir os estudos para a associação de bactérias com plantas silvestres. Os objetivos do presente trabalho foram isolar, caracterizar e identificar bactérias associadas a bromélias de cangas, e correlacionar a diversidade de bactérias com as diferentes espécies de plantas, com as características do solo e com as diferentes populações amostradas. Foi realizada a coleta de raízes de Dyckia excelsa, Dyckia leptostachya e Deuterocohnia meziana em três locais distintos: Fazenda São João, Parque Municipal de Piraputangas, e Sítio Arqueológico Lajedo, em Corumbá, Mato Grosso do Sul, Brasil. Para contagem e isolamento das bactérias epifíticas, as raízes foram imersas em tampão PBS e agitadas a 100 rpm. As bactérias endofíticas foram contadas e isoladas após a desinfecção superficial dos tecidos, que foram triturados em tampão PBS e submetidos à agitação de 150 rpm. As amostras foram diluídas em tampão PBS e semeadas em meio TSA 4% e incubadas a 28 ºC. A caracterização morfológica baseou-se na forma, borda, brilho, elevação, cor e tamanho, que foram utilizados para análise de agrupamento. A análise de BOX-PCR consistiu na amplificação das regiões boxA. Isolados representativos de cada padrão de banda e os que não tiveram seu DNA amplificado pela técnica de BOX-PCR, tiveram a região 16S rDNA sequenciada. A árvore filogenética foi construída utilizando o programa MEGA6 com o método Neighbor-Joining. Foram feitas análises de correlação para verificar a biodiversidade com as características do solo, com as espécies vegetais e com o tamanho das ilhas de solo. Os resultados das características morfológicas mostraram que existe alta diversidade fenotípica em sistemas radiculares que foi confirmada através da técnica de BOX-PCR, a qual mostrou variabilidade intragenérica e intraespecífica nas bactérias isoladas das bromélias. Os resultados do sequenciamento da subunidade 16S rRNA mostraram que o gênero Bacillus (54%) foi o mais representativo dentre as sequências obtidas, seguido pelo gênero Alcaligenes, Lysinibacillus e Paenibacillus. Foi observada uma correlação positiva da biodiversidade bacteriana com algumas características físico-químicas do solo: ferro, fósforo e argila. O índice de Shannon-Wiener mostrou que existe uma diversidade moderada de bactérias de acordo com as populações de bromélias amostradas. Um grande número de bactérias identificadas com o gênero Bacillus é encontrado em ambientes semelhantes a cangas, pois este gênero possui adaptações para sobrevivência em ambientes hostis, como a produção de endósporos, capacitando-o para sobreviver em ambientes com mudanças dramáticas de temperatura. Em conclusão as análises de BOX-PCR complementou a técnica de sequenciamento, mostrando uma diversidade intragenérica e intraespecífica entre os isolados.

ABSTRACT - The association of bacteria with plants is widely studied in different environments, especially in cultivated plants. However, it is necessary to expand the studies to the association of bacteria with wild plants. The aims of this study were to isolate, characterize and identify bacteria associated with bromeliads from “cangas”, and correlate the diversity of bacteria with the different species of plants, with soil characteristics and with the different populations sampled. It was collected roots of Dyckia excelsa, Dyckia leptostachya and Deuterocohnia meziana in three distinct localities: Farm São João, Parque Municipal Piraputangas and Sítio Arqueológico Lajedo in Corumbá, Mato Grosso do Sul State, Brazil. To count and isolation of epiphytic bacteria, the roots were immersed in PBS buffer and agitated at 100 rpm. The endophytic bacteria were counted and isolated after surface disinfection of tissues, which were macerated in PBS buffer and subjected to agitation of 150 rpm. Samples were diluted in PBS buffer and plated on trypticase soy agar 4% and incubated at 28 ° C. Morphological characterization was based on the shape, border, glossiness, elevation, color and size, which were used for cluster analysis. The BOX-PCR analysis was to amplify the regions boxA. Representative isolates of each fingerprint and those who did not have their DNA amplified by BOX-PCR, had the 16S rDNA sequenced. The phylogenetic tree was constructed using the MEGA6 program with the neighbor-joining method. Correlation analyzes were made to verify the biodiversity with the characteristics of the soil, with the plant species and the size of the soil islands. The results of the morphological characteristics showed that there is high phenotypic diversity in root systems, confirmed by BOX-PCR analysis, which showed intrageneric and intraspecific variability in bacteria isolated from bromeliads. The sequencing results showed that the genus Bacillus (54%) was the most representative among the sequences obtained, followed by the genus Alcaligenes, Lysinibacillus and Paenibacillus. The results showed a positive correlation of bacterial biodiversity with some physical and chemical characteristics of the soil: iron, phosphorus and clay. The Shannon-Wiener index showed that there was a moderate range of bacteria according to the populations sampled bromeliads. A large number of bacteria identified as Bacillus is found in similar environments to sarongs because this genre has adaptations for survival in hostile environments such as the production of endospores, enabling it to survive in environments with dramatic temperature changes. In conclusion the BOX-PCR analysis complemented the sequencing technique, showing a intragenérica and intraspecific diversity among the isolates.