Purificação e caracterização molecular de um inibidor de peptidase de sementes de Platypodium elegans Vogel (FABACEAE) e o seu potencial antimicrobiano

Abstract

Os inibidores de peptidase de plantas (IPs) desempenham um importante papel no desenvolvimento vegetal através da regulação das atividades de peptidases envolvidas em processos fisiológicos. Além disso, os IPs são associados ao mecanismo de defesa natural das plantas contra insetos, fungos e bactérias, despertando um iminente interesse biotecnológico. Neste estudo objetivou-se isolar e purificar um inibidor de tripsina presente nas sementes de Platypodium elegans (Fabaceae), denominado PeTI (inibidor de tripsina de Platypodium elegans) e avaliar seu potencial biológico antimicrobiano contra cepas bacterianas. O PeTI foi purificado em duas etapas cromatográficas. Quando submetido à cromatografia líquida de alta eficiência em coluna C-18, PeTI apresentou sete picos, possivelmente indicando a presença de isoformas. A PAGE-SDS revelou que PeTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica, apresentando uma massa molecular aparente de 19 kDa, sob condições reduzidas e não-reduzidas. Além disso, PeTI apresentou uma razão de inibição de 1:1 para tripsina bovina. Características similares (estequiometria 1:1, constante de inibição (ki) temperatura, pH e DTT) são comumente observados para IPs da família Kunitz. Assim sugerimos que PeTI possa pertencer a mesma família. O estudo de estabilidade indicou que o inibidor manteve-se estável entre uma ampla variação de temperatura (37–80°C) e pH. Entretanto, o PeTI apresentou uma redução em sua atividade inibitória após incubado com ditiotreitol (DTT) a 10 e 100 mM, após 15 minutos de incubação . O PeTI apresentou atividade inibitória in vitro contras as cepas bacterianas gram-positivas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e gram-negativas: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebisiella pneumoniae. A atividade biológica reforça a participação do inibidor na defesa vegetal e demonstra o potencial biotecnológico de PeTI, que deve ser futuramente investigado como uma ferramenta de controle de patógenos.

ABSTRACT - Plant peptidase inhibitors (PIs) play an essential role in plant development regulation due to peptidase activities that are involved in physiological processes of the plant. Furthermore, the IPs are also associated with defense mechanism. Thus, the plant peptidase inhibitors have some characteristics of biotechnological interest to be related to the plant defense against insects, fungi and bacteria and they are often found in leguminous seeds. This study, we isolatedand purified an inhibitor from Platypodium elegans (Fabaceae) seeds, named PeTI (Platypodium elegans trypsin inhibitor) and its biological potential was evaluated. The PeTI was purified by ion exchange column, followed by affinity column. When subjected to high-performance liquid chromatography on C-18 column, PeTI presented seven peaks, possibly indicating the presence of isoforms. SDS-PAGE revealed that PeTI consists of a single polypeptide chain, having an apparent molecular mass of 19 kDa under reducing and non-reducing conditions. Moreover , PeTI showed inhibitory activity against trypsin and bovine chymotrypsin, and showed an inhibition ratio of 1: 1, inhibition constant (Ki) to bovine trypsin. Stability studies indicated that PeTI was stable between a wide range of temperature (37-80°C) and pH. However, PeTI had a decrease in its inhibitory activity when incubated with diitreitol (DTT) to 10 and 100 mM after 15 minutes. PETI had inhibitory activity in vitro cons the gram-positive bacterial strains: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, and gram-negative: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes and Klebisiella pneumoniae. Biological activity increases the participation of the inhibitor in plant defense and has the potential to PeTI being investigated as a biotechnological tool for the control of pathogens.