Identificação de potenciais imunógenos de corynebacterium pseudotuberculosis e avaliação de vacinas de DNA e de subunidade contra linfadenite caseosa

Abstract

A linfadenite caseosa (LC) é uma enfermidade que afeta ovinos e caprinos e ocasionalmente o homem, causada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis. A LC é uma das doenças de grande importância econômica na ovinocultura e caprinocultura. Vacinas comerciais disponíveis não oferecem proteção adequada aos animais. Portanto, o desenvolvimento de vacinas mais eficientes contra LC é necessário. Desta forma, objetivou-se com este estudo construir uma biblioteca de expressão gênica de C. pseudotuberculosis e identificar, por imunovarredura, genes que codificam possíveis proteínas antigênicas para o desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA e subunidade contra LC. Uma cepa selvagem de C. pseudotuberculosis foi utilizada para a extração e digestão parcial do DNA genômico. Sequências entre 1.000 e 5.000 pares de bases foram cortadas do gel, purificadas e os fragmentos obtidos do DNA digerido foram ligados no vetor bacteriófago ZAP Express, empacotados em fagos e transfectados em Escherichia coli. Para a imunovarredura utilizou-se um pool de soros de ovinos positivos e um pool de soros negativos para LC. Na imunovarredura foram identificados quatro clones que reagiram fortemente aos soros. Os clones foram confirmados, após a realização da PCR e sequenciamento para comparação genômica de C. pseudotuberculosis no GenBank. Esses genes foram identificados, com identidade entre 99% e 100% e E-value de 0.0, como codificadores de proteínas de membrana. Proteínas desse tipo podem ser antigênicas, podendo favorecer o desenvolvimento de vacinas de subunidades ou de DNA contra LC, bem como o desenvolvimento de testes sorológicos para diagnóstico. O uso de imunovarredura de biblioteca de expressão gênica apresentou-se como uma técnica sensível e eficiente na identificação de prováveis genes imunodominantes. Um desses genes foi o Xa1 e por isso ele foi avaliado como imunógeno na forma de vacina de DNA, bem como na forma de subunidade recombinante. Camundongos foram imunizados com pcDNAXa1, pcDNAXa1+XA1r-Montanide e XA1r-Montanide e desafiados com uma cepa virulenta de C. pseudotuberculosis. O estado clínico e as alterações anatomopatológicas foram avaliadas após o desafio. A detecção de IgG específico no soro dos camundongos imunizados, bem como seus isotipos IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA indireto. Os níveis de IFN- e IL-10 foram determinados por ELISA de captura a partir dos sobrenadantes de culturas de esplenócitos, estimulados com XA1r. As respostas imunes celular e humoral induzidas pelas formulações vacinais pcDNAXa1, pcDNAXa1+XA1r-Montanide e XA1r-Montanide, foram capazes de proteger camundongos após o desafio com C. pseudotuberculosis virulenta, resultando na sobrevivência de camundongos sem alterações clínicas e anatomopatológicas características de LC. Essas formulações podem ser promissoras contra a LC em ovinos e caprinos.

ABSTRACT - Vaccines The caseous lymphadenitis (CLA) is a disease that affects sheep and goats and occasionally humans, caused by the bacterium Corynebacterium pseudotuberculosis. CLA is a disease of economic importance in the sheep and goat industry. Commercial vaccines available do not provide adequate protection for animals. Therefore, the development of more efficient vaccines is required. Thus, the aim of this study was to construct a gene expression library of C. pseudotuberculosis and identify, for immunoscreening, genes encoding potential antigenic proteins for the development and evaluation of DNA and subunit vaccines against CLA. A wild strain of C. pseudotuberculosis was used for the extraction and partial digestion of genomic DNA. Sequences between 1,000 and 5,000 base pairs were excised from the gel, purified and the digested DNA fragments obtained were ligated into the phage vector ZAP Express, packaged into phage and transfected into Escherichia coli. For immunoscreening, we used a pool of positive sheep sera and a pool of negative sheep sera for CLA. In immunoscreening four clones were identified which reacted strongly to the sera. Clones were confirmed after the completion of PCR and sequencing for genomic comparison of C. pseudotuberculosis in GenBank. These genes were identified with identity between 99% and 100% and E-value of 0.0, and encoding membrane proteins. Proteins of this type may be antigenic and may promote the development of subunit vaccines or DNA from CLA, as well as the development of serological tests for diagnosis. The use of immunoscreening of gene expression library was presented as a sensitive and efficient technique to identify genes likely immunodominant. One of these genes was Xa1 and therefore it has been reported as an immunogen in the form of DNA vaccines, as well as recombinant subunit. Mice were immunized with pcDNAXa1, pcDNAXa1+XA1r-Montanide and XA1r-Montanide and challenged with a virulent strain of C. pseudotuberculosis. The clinical status and pathological changes were evaluated after the challenge. The detection of specific IgG in the serum of immunized mice, as well as their isotypes IgG1 and IgG2a, were measured by ELISA. IFN- and IL-10 were determined by capture ELISA from the supernatants of splenocyte cultures stimulated with Xa1r. The humoral and cellular immune responses induced by the vaccine formulations pcDNAXa1, pcDNAXa1+XA1r-Montanide and XA1r-Montanide, were able to protect mice after challenge with virulent C. pseudotuberculosis, resulting in survival of mice without clinical and pathological features CLA. These formulations may be promising against CLA in sheep and goats.