Avaliação das propriedades adesivas e inflamatórias das células endoteliais progenitoras circulantes de pacientes com anemia falciforme

Abstract

O endotélio tem participação importante na fisiopatologia da anemia falciforme (AF), por sofrer ativação e disfunção endotelial decorrente da hemólise intravascular e da inflamação crônica e por interagir com as hemácias, leucócitos e plaquetas no processo vaso-oclusivo. As células endoteliais, uma vez ativadas, induzem a via de sinalização inflamatória levando ao aumento da produção de mediadores inflamatórios e de expressão das moléculas de adesão. As células endoteliais progenitoras circulantes ou Blood outgrowth endotelial cells (BOECs) são isoladas a partir do sangue periférico de adultos, possuem alta capacidade proliferativa e fenótipo estável ao longo da cultura in vitro e diversos estudos têm utilizado-as como fonte de células no processo de regeneração vascular, biomaterial na terapia gênica, modelo de estudo fisiopatológico de doença vascular. Este trabalho teve como objetivo padronizar a cultura de BOEC com o intuito de servir como modelo de estudo in vitro sobre a função endotelial na AF, avaliar as propriedades adesivas e inflamatórias dessas células endoteliais de pacientes com anemia falciforme e comparando essas propriedades com as de indivíduos saudáveis (controles). As culturas de BOECs foram estabelecidas para pacientes com anemia falciforme (AF, N=11) e indivíduos saudáveis (Con, N=5). Os resultados de ensaio de adesão celular estática mostraram que as hemácias normais do grupo controle apresentaram uma adesão significativamente maior nas BOECs de pacientes com AF. Entre as BOECs de controle e de pacientes com AF não foram detectadas por citometria de fluxo diferenças significativas de expressão das moléculas de adesão VCAM-1, CD36, Selectinas P e E, integrina v3 e Lu/BCAM, mas as BOECs AF demonstraram ser pró-inflamatórias, pois níveis significativamente elevados de IL-8 foram determinados por ELISA nos sobrenadantes das BOECs AF comparados aos sobrenadantes de BOECs Con. Pelo método de PCR array foram analisados a expressão de 84 genes endoteliais e dez genes foram identificados como significativamente subexpressos () ou superexpressos () nas BOECs de paciente AF em relação às BOECs de controle, CCL2 (), FAS (), PTGIS (), SELE (), SOD1 (), TIMP1 (), VWF (), IL6 (), IL11 (), PECAM (), mas essas diferenças não explicam as propriedades adesivas e inflamatórias encontradas alteradas nas BOECs AF. Este estudo confirmou a possibilidade de se estabelecer culturas de BOECs de pacientes com anemia falciforme e de indivíduos saudáveis. Os resultados deste estudo mostram pela primeira vez na literatura que as células endoteliais de pacientes com anemia falciforme possam ter propriedades adesivas e inflamatórias anormais mesmo fora do ambiente da circulação do paciente com AF onde existe vaso-oclusão e inflamação crônica. Diante dos dados obtidos, as BOECs demonstraram ser um bom modelo de estudo in vitro de AF e que abrem uma nova perspectiva para contribuir no estudo de novas terapêuticas e na fisiopatologia da anemia falciforme.

ABSTRACT - The endothelium has an important role in sickle cell anemia (SCA), undergoing endothelial activation and dysfunction as a result of intravascular hemolysis and chronic inflammation and interacting with red cells, leukocytes and platelets during the vaso-occlusive process. The endothelial cells, once activated, induce the inflammatory signaling pathway, leading to an increase in the production of inflammatory mediators and adhesion molecule expression. Blood outgrowth endothelial cells (BOECs) are isolated from adult peripheral blood and have a high proliferative capacity and a stable phenotype during in vitro culture. These cells have been used in diverse studies as a source for cells used in vascular regeneration, as biomaterial in gene therapy and as a pathophysiological vascular disease study model. This study aime to establish the culture of BOEC for use as an in vitro study model for endothelial function in sickle cell anemia. The cultures were employed to evaluate the adhesive and inflammatory properties of these endothelial cells in sickle cell anemia patients by comparing these properties to those of healthy individuals. BOEC cultures were established for sickle cell anemia patients (SCA, N=11) and for healthy individuals (Con, N=5). The results of the static cell adhesion assay demonstrated that normal red cells of control group presented a significantly higher adhesion of the BOECs of sickle cell anemia patients. For control BOECs and patients with sickle cell anemia, flow cytometry did not detect significant differences in the expressions of adhesion molecules VCAM-1, CD36, P and E Selectins, integrin v3 and BCAM/Lu, but sickle cell anemia BOECs were found to be pro-inflammatory as a significant level of IL-8 production was found in the supernatants of sickle cell anemia BOECs compared to Con BOECs (as determined by ELISA). By PCR array method, 84 endothelial genes were analysed and ten were identified as significantly downregulated () or uperregulated () in BOECs of sickle cell anemia patients in relation to control BOECs, CCL2 (), FAS (), PTGIS (), SELE (), SOD1 (), TIMP1 (), VWF (), IL6 (), IL11 (), PECAM (). These differences in gene expression do not explain the altered adhesive and inflammatory properties found in SCA BOECs. This study confirms the possibility of establishing BOEC cultures from patients with sickle cell anemia and from healthy individuals. The results of this study demonstrate, for the first time in the literature, that endothelial cells of sickle cell disease patients may have atypical adhesive and inflammatory properties even outside the circulation of patients. BOECs were found to be a good model for the in vitro study of sickle cell disease and open new perspectives to contribute to the study of new therapeutic methods and the pathophysiology of sickle cell anemia.