Desenvolvimento de nested PCR para a detecção de DNA de membros do complexo Mycobacterium tuberculosis em tecidos de bovinos e bubalinos

Abstract

A tuberculose bovina causada por Mycobacterium bovis,um membro do complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT),é uma enfermidade crônica que acomete, além dos bovinos e bubalinos, também animais silvestres e o homem. A enfermidade é endêmica no Brasil, e seu controle se tornou alvo de exigências sanitárias internacionais. Atualmente vários sistemas de diagnóstico molecular, especialmente aqueles baseados na tecnologia de PCR em tempo real, têm sido desenvolvidos por serem mais rápidos e apresentarem maiores possibilidades de automação. Técnicas de PCR em tempo real aplicadas diretamente a tecidos ainda são pouco exploradas e na maioria dos casos as reações carecem de validação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver duas nested PCR a partir de PCR convencional seguida de PCR em tempo real para identificar bactérias do CMT e M. bovis em tecidos de bovinos e bubalinos. No primeiro estudo, a nested PCR baseada no alvo rv2807 apresentou 100% de especificidade analítica para CMT quando testada com DNA de cepas de referência de micobactérias não-tuberculosas estreitamente relacionadas com Actinomycetales. A sensibilidade clínica da nested PCR foi de 76,7% detectada com tecidos de amostras positivas para CMT (confirmadas por PCR convencional de colônias). Evidenciou-se especificidade clínica de 100% com DNA de amostras de tecidos de bovinos, com resultados negativos no teste cervical comparativo (TCC). No segundo estudo uma nested PCR tendo como alvo a região TbD1 alcançou sensibilidade clínica de 76,0% em amostras de tecido de animais que apresentavam resultados positivos em TCC, assim como daqueles com lesões compatíveis com tuberculose (LCT), que apresentaram culturas positivas. Detectou-se especificidade clínica de 100% em amostras de tecido de animais com resultados negativos no TCC, sem lesões visíveis (SLV) e com cultura negativa. Não foram encontradas diferenças significativas entre nested PCR e cultura para detectar animais positivos ao TCC com LCT ou SLV.A utilização dos ensaios de nested PCR para detectar CMT e M. bovis em homogeneizados de tecidos permitiu rápido diagnóstico da tuberculose bovina e bubalina.

A tuberculose bovina causada por Mycobacterium bovis,um membro do complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT),é uma enfermidade crônica que acomete, além dos bovinos e bubalinos, também animais silvestres e o homem. A enfermidade é endêmica no Brasil, e seu controle se tornou alvo de exigências sanitárias internacionais. Atualmente vários sistemas de diagnóstico molecular, especialmente aqueles baseados na tecnologia de PCR em tempo real, têm sido desenvolvidos por serem mais rápidos e apresentarem maiores possibilidades de automação. Técnicas de PCR em tempo real aplicadas diretamente a tecidos ainda são pouco exploradas e na maioria dos casos as reações carecem de validação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver duas nested PCR a partir de PCR convencional seguida de PCR em tempo real para identificar bactérias do CMT e M. bovis em tecidos de bovinos e bubalinos. No primeiro estudo, a nested PCR baseada no alvo rv2807 apresentou 100% de especificidade analítica para CMT quando testada com DNA de cepas de referência de micobactérias não-tuberculosas estreitamente relacionadas com Actinomycetales. A sensibilidade clínica da nested PCR foi de 76,7% detectada com tecidos de amostras positivas para CMT (confirmadas por PCR convencional de colônias). Evidenciou-se especificidade clínica de 100% com DNA de amostras de tecidos de bovinos, com resultados negativos no teste cervical comparativo (TCC). No segundo estudo uma nested PCR tendo como alvo a região TbD1 alcançou sensibilidade clínica de 76,0% em amostras de tecido de animais que apresentavam resultados positivos em TCC, assim como daqueles com lesões compatíveis com tuberculose (LCT), que apresentaram culturas positivas. Detectou-se especificidade clínica de 100% em amostras de tecido de animais com resultados negativos no TCC, sem lesões visíveis (SLV) e com cultura negativa. Não foram encontradas diferenças significativas entre nested PCR e cultura para detectar animais positivos ao TCC com LCT ou SLV.A utilização dos ensaios de nested PCR para detectar CMT e M. bovis em homogeneizados de tecidos permitiu rápido diagnóstico da tuberculose bovina e bubalina.