Leishmania : caracterização molecular, PCR em tempo real para o diagnóstico da leishmaniose visceral e diversidade genética de kDNA

Abstract

As leishmanioses são um complexo de diferentes enfermidades ocasionadas por distintas espécies do gênero Leishmania. Estas doenças de evolução crônica podem afetar a pele, mucosas e vísceras dependendo da espécie de Leishmania e da resposta imune do hospedeiro. Os objetivos do presente trabalho foram: identificar por meio da Reação em Cadeia da Polimerase - PCR as espécies dos agentes etiológicos da leishmaniose visceral e tegumentar em pacientes diagnosticados em Campo Grande-MS; avaliar a PCR em tempo real (PCR-TR) em amostras de sangue periférico para diagnóstico da leishmaniose visceral e detectar variabilidade genética em kDNA de Leishmania isolada de pacientes com leishmaniose visceral e/ou cutânea. Foram analisados 39 isolados de Leishmania criopreservados, obtidos por meio de aspirado medular e/ou biópsia de lesão, conforme a suspeita clínica. Os isolados foram submetidos à extração de DNA e à PCR com os iniciadores RV1/RV2 para Leishmania (Leishmania) chagasi, a1/a2 para a identificação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e b1/b2 para Leishmania (Viannia) braziliensis. Foi realizada a análise comparativa entre exames moleculares (PCR-TR - sistema Sybr Green Rox Plus e PCR padrão) em sangue periférico e técnicas parasitológicas (aspirado de medula e cultura). Foram utilizados 100 amostras de sangue periférico provenientes de pacientes com suspeita clínica de leishmaniose visceral. Por meio da cultura obteve-se outros 47 isolados de Leishmania, que foram submetidos ao sequenciamento da região ITS e a PCR-RFLP com os iniciadores LINR4/LIN19 e enzimas RsaI e HpaII. Leishmania (Leishmania) chagasi foi a única espécie identificada em 37 casos de leishmaniose visceral. Leishmania (Leishmania) amazonensis foi identificada em dois isolados de pacientes com diagnóstico de leishmaniose tegumentar. Das 100 amostras analisadas, 65 (65%) foram positivas para PCR, 62 (62%) para PCR-TR e 45 (45%) para o esfregaço de aspirado de medula óssea e das 96 amostras, 13 (13,54%) foram positivas na cultura. A PCR-TR mostrou maior concordância com a PCR (95%) seguida do esfregaço de medula óssea (83,0%) e cultura (53,1%). A análise genética dos 47 isolados de Leishmania forneceu 30 genótipos diferentes e pela comparação das regiões ITS1 com as sequências depositadas no Genebank foi identificado na maioria das amostras de leishmaniose visceral (44), L. chagasi como agente etiológico e nos casos de leishmaniose tegumentar identificou-se L. braziliensis e L. major. Os resultados confirmaram a possibilidade do uso dos três pares de iniciadores como ferramenta na caracterização de isolados de Leishmania, a PCR-TR em sangue periférico mostrou ser uma alternativa de diagnóstico da leishmaniose visceral a partir de amostras coletas por método menos invasivo e a técnica PCR/RFLP detectou elevada variabilidade genética em kDNA de Leishmania (Leishmania) chagasi de casos humanos de Mato Grosso do Sul.

Leishmaniasis is a complex of different diseases caused by different species of Leishmania. These diseases of evolution chronic can affect the skin, mucous membranes and viscera depending on the kind of Leishmania and the host immune response. The objectives of this study were to determine by the Polymerase Chain Reaction- PCR species of etiologic agents of visceral leishmaniasis and cutaneous in patients diagnosed in Campo Grande-MS, to evaluate the PCR in real time (RT-PCR) in peripheral blood samples for diagnosis visceral leishmaniasis and detect genetic variability in the kDNA Leishmania isolated from patients with visceral and cutaneous leishmaniasis. We analyzed 39 cryopreserved Leishmania isolates obtained by through bone marrow aspiration and / or biopsy of the lesion, as the suspicion clinic.The isolates were submitted to DNA extraction and PCR with RV1/RV2 primers for Leishmania (Leishmania) chagasi, for a1/a2 identification of Leishmania (Leishmania) amazonensis and B1/B2 for Leishmania (Viannia) braziliensis. We performed a comparative analysis between molecular tests (RT-PCR - Rox Plus system Sybr Green and PCR standard) in peripheral blood and parasitological techniques (aspirate marrow and culture). A total of 100 samples of peripheral blood from patients with clinical suspicion of visceral leishmaniasis. Through the other culture was obtained 47 isolates of Leishmania, which were submitted to sequencing of the ITS region and RFLP-PCR with primers LINR4/LIN19 and enzymes RsaI and HpaII. Leishmania (Leishmania) chagasi was the only species identified in 37 cases of visceral leishmaniasis. Leishmania (Leishmania) amazonensis was identified in two isolates from patients diagnosed with cutaneous leishmaniasis. Of the 100 samples examined 65 (65.0%) were positive for PCR, 62 (62.0%) for RT-PCR and 45 (45.0%) for the smear of bone marrow aspirate and 96 samples, 13 (13.54%) were positive for culture. The RT-PCR showed greater agreement with PCR (95.0%) followed by bone marrow smear (83.0%) and culture (53.1%). Genetic analysis of 47 Leishmania isolates gave 30 different genotypes and comparison of the ITS1 regions with the sequences deposited in Genebank was identified in most samples (44) L. chagasi the causative agent of visceral leishmaniasis and in cases of cutaneous leishmaniasis were identified L. braziliensis and L. major. The results confirmed the possibility of using three pairs of primers as a tool in the characterization of isolates of Leishmania, the RT-PCR in peripheral blood may be an alternative diagnostic visceral leishmaniasis from samples collected by a method less invasive and PCR / RFLP detected a high genetic variability in kDNA of Leishmania (Leishmania) chagasi human cases of Mato Grosso do Sul.