Efeito do silenciamento gênico de ACVR1 (r206h) por sirna, sobre a expressão de ACVR1 e BMP4 em células mononucleares de sangue periférico de pacientes portadores de fibrodisplasia ossificante progressiva

Abstract

Introdução: FOP é uma doença genética autossômica dominante complexa e rara, caracterizada por anomalias congênitas esqueléticas sendo o halux valgo uma característica patognomonica. Evolui com ossificação heterotópica progressiva, formando um exo esqueleto até a adolescencia. Os portadores apresentam mutação em heterozigose (c.617G>A, p.R206H) no gene ACVR1, no cromossomo 2q23-24. Mutações no ACVR1 são de ganho de função. A substituição da arginina pela histidina na mutação, cria uma alteração alostérica dentro do domínio do receptor, pH-sensível, ativando a via de sinalização das BMPs independentemente da BMP. Portanto a fisiopatologia da FOP envolve o desequilíbrio da via de sinalização das BMPs e sua interação complexa com múltiplas vias moleculares e do sistema imunológico. Experimentos in vitro, de cultivo primário de leucócitos de pacientes não têm sido explorados e deverão ser importantes modelos na avaliação da via gatilho da doença e de sua interação com medicamentos utilizados no controle das crises agudas. Objetivos: Determinar um modelo experimental para o silenciamento da expressão gênica do ACVR1 (R206H) em cultura de PBMC de pacientes com FOP obtidas por cultivo primário e avaliar o efeito do siRNA sobre a expressão de ACVR1 e BMP4. Métodos: Amostras de sangue total foram coletadas para cultivo de células mononucleares (PBMC) de doze voluntários (6 portadores de FOP e 6 controles sadios). Células foram tratadas com siRNA para ACVR1mutado e siRNA para ACVR normal, carreadas por nanopartículas de carbono. O RNA total extraído pelo Stat60, submetido a RT e PCRtr. Teste t não pareado foi utilizado para avaliar a expressão gênica. Resultados e Conclusão: O presente trabalho mostra que estudos moleculares de silenciamento gênico utilizando o modelo de PBMC e nanopartículas de carbono, é viável. Como é um modelo relativamente simples permitirá futuros estudos na compreensão da fisiopatologia da FOP. Observamos no presente trabalho que houve o silenciamento do gene alvo ACVR1, embora o mecanismo pelo qual o ACVR1 ficou superexpresso não tenha ficado muito claro. Mas quando observamos a expressão do gene ACVR1 e analisamos em conjunto com a expressão de BMP4, percebemos que ocorreu uma modulação quando as células foram tratadas com RNAi.

ABSTRACT - Introduction: FOP is a complex autosomal dominant genetic rare disease and characterized by congenital skeletal abnormalities being the hallux valgus one pathognomonic feature and heterotopic ossification progressive postnatal. The patients present a heterozygous mutation (c.617G> A, p.R206H) in the ACVR1 gene, on chromosome 2q23-24. Studies of the pathophysiology of FOP involve imbalance in the signaling pathway of BMP and its interaction with multiple molecular pathways and the immune system. ACVR1 mutations are gain of function, activating the signaling pathway of BMP independent of ligand. The substitution of arginine for histidine at mutation creates an allosteric change in the receptor domain, activating the receptor independently of the BMP. Experiments in vitro of primary culture of leukocytes of patients have not been explored and will be important of models in assessing via trigger of the disease interaction with medication used to control acute flare-ups. Objectives: Determination of an experimental model for the silencing of gene expression of ACVR1 (R206H) in cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of FOP patients obtained by primary culture and the effect of siRNA on the expression of ACVR1 and BMP4. Methods: Whole blood samples were collected for mononuclear cell cultures (PBMC) of ten volunteers (6 people with FOP and 4 healthy controls). Cells were treated with siRNA and siRNA for mutated ACVR1 and normal ACVR1. Cells were treated with siRNA for ACVR1 mutated and with siRNA for normal ACVR1. Total RNA extracted by Stat60 subjected to RT and PCRtr. Unpaired t test was used to assess gene expression. Results and Conclusion: This work shows that molecular studies of gene silencing using the model of PBMC and carbon nanoparticles is feasible. Since it is a relatively simple model, it will allow future studies in the understanding of the pathophysiology of the FOP. We observed in the present work that there was the silencing of the ACVR1 gene, though the mechanism by which the ACVR1 was superexpressed has not been very clear. But when we observe the expression of the gene ACVR1 and analyze together with the expression of BMP4, we realized that there was a modulation when the cells were treated with RNAi.