Avaliação do uso de proteínas recombinantes de Mycobacterium bovis como antígenos em teste intradérmico para o diagnóstico da tuberculose bovina

Abstract

A tuberculose bovina é uma doença de importância econômica e zoonótica, causada principalmente por Mycobacterium bovis. Como não existe uma vacina eficaz para essa doença, os programas para seu controle e erradicação consistem no diagnóstico e abate de animais infectados com base nos resultados do teste de imunidade celular in vivo, o teste intradérmico. Nesse ensaio são utilizados os derivados proteicos purificados (PPD) de M. bovis que são capazes de induzir reações de hipersensibilidade tardia em animais infectados. No entanto, devido a problemas relacionados principalmente à especificidade da mistura de proteínas que compõem o PPD, que pode resultar em reações cruzadas com outras micobactérias, a busca por novos antígenos se faz necessária. Nesse sentido, proteínas específicas de M. bovis envolvidas na resposta imune celular têm sido testadas em substituição ao PPD bovino no teste intradérmico, com resultados promissores. O objetivo do presente estudo foi produzir proteínas recombinantes de M. bovis e avaliá-las como antígenos em teste intradérmico em Cavia porcellus e bovinos. As proteínas recombinantes ESAT-6, PE13, PE5, ESX-1, Mb0143 e TB10.4 foram produzidas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia de afinidade agarose-níquel em condição nativa. A proteína ESAT-6 foi purificada também em condição desnaturante. As proteínas ESAT-6, PE13, PE5 e ESX- 1, quando testadas em Cavia porcellus, apresentaram capacidade para diferenciar animais previamente sensibilizados com cepa M. bovis AN5 inativada dos não sensibilizados, quando combinadas em forma de um coquetel contendo 40 g de cada proteína. As condições de solubilização e purificação influenciaram o desempenho antigênico das proteínas em estimular hipersensibilidade tardia, pois a proteína ESAT-6 produzida em condição desnaturante desencadeou reação inespecífica nos animais não sensibilizados, enquanto que aquelas produzidas em condições nativas e aplicadas em baixas concentrações (6, 12, 24 e 48 g) induziram reações significativas nos animais sensibilizados, confirmando o seu potencial para o diagnóstico. Quando testadas em bovinos, apenas as proteínas ESX-1, Mb0143 e PE5 aplicadas individualmente, foram capazes de diferenciar bovinos sensibilizados de não sensibilizados quando 320 g das proteínas foram injetadas. As proteínas recombinantes de M. bovis aqui caracterizadas demonstraram resultado promissor para serem utilizadas como antígenos em teste intradérmico para o diagnóstico da tuberculose bovina.

Bovine tuberculosis is a disease of economic and zoonotic importance, mainly caused by Mycobacterium bovis, and as there is no an effective vaccine for this disease, the control and eradication consist in the diagnosis and slaughter of the infected animals based on the tuberculin skin test result. In this assay purified protein derivative (PPD) of M. bovis that induce a delayed hypersensitivity reactions in infected animals is used. However, due to problems mainly related to the specificity of the PPD protein mixture, which may result in cross-reactions with other mycobacteria, the search for new antigens are needed. Thus, specific proteins of M. bovis involved in cell mediated immunity have been assessed to replace the bovine PPD in skin tests showing promising results. The aim of this study was to produce recombinant proteins of M. bovis and evaluate them as antigens in skin tests in guinea pigs and cattle. The recombinant proteins ESAT-6, PE13, PE5, ESX-1 Mb0143 and TB10.4 were produced in Escherichia coli and purified by affinity chromatography using nickel agarose resin, under native condition. The ESAT-6 protein was also purified in denaturing condition. The proteins ESAT-6, PE13, PE5 and ESX-1, when combined in the form of a cocktail containing 40 µg of each protein, differentiate guinea pigs were able previously sensitized with M. bovis strain AN5 from non-sensitized animals. The purification conditions influenced the antigenic performance of the proteins to stimulate a delayed hypersensitivity response, since the ESAT-6 protein produced in denaturing condition triggered nonspecific reactions in non-sensitized animals, whereas under native condition and applied at low concentrations (6, 12, 24 and 48 µg) resulted in significant reactions only in sensitized animals, confirming their potential for diagnosis. When tested in cattle, only the proteins ESX-1, Mb0143 and PE5 individually were able to differentiate between non-sensitized and sensitized cattle when 320 µg of protein was injected. The recombinant proteins of M. bovis showed promising results for use on skin test for the diagnosis of bovine tuberculosis.